QbD的起源

　　QbD在生物制藥行業(yè)的作用日趨突出，該行業(yè)要遵循美國FDA頒發(fā)的創(chuàng)新醫(yī)藥制造業(yè)PATA框架和質量保證文件。其所包含的ICH指導原則中的相關概念得到了全球的普遍認可，ICH Q8 藥物開發(fā)，ICH Q9質量風險管理，ICH Q10藥物質量體系，ICH Q11原料藥開發(fā)和生產。在過去的十年里，生物技術行業(yè)和其監(jiān)管機構尤其是美國FDA實施了必要的基礎工作來為QbD的實施鋪平道路，并解決了多種包括可能影響其成功實施的問題。雖然到目前為止僅有一個生物藥用QbD的方式通過了申請，但其相關的工具和方法已經成為全球化制藥公司的工作過程中的固有形式。

　　本文將列舉生物仿制藥GCSF進行逐步純化工藝開發(fā)的例子對QbD進行詮釋，并通過案例分析幫助那些在想在生物制品工藝開發(fā)和商業(yè)化生產時實施QbD的人們。

　　QbD是什么

　　在ICH Q8中對QbD進行了定義，即在可靠的科學和質量風險管理的基礎上，預先定義好目標并強調對產品與工藝的理解以及工藝控制的一個系統(tǒng)的研發(fā)方法。傳統(tǒng)方法是廠家確定目標產品定義工藝，然后針對產品的期望結果進行檢測。如果產品質量達到預期，廠家就會固定工藝，然后在很小的工藝操作范圍內進行生產。這就是所謂的“如果操作的過程是一致的，那么生產的產品也應該是一致的”，這種方法已經被生物制藥公司應用了30多年了。而QbD方法是針對生物藥的開發(fā)與生產，與上面描述的傳統(tǒng)方法有著顯著的差異，結果說明見圖1。關鍵步驟：（1）確認對安全性和有效性有顯著影響的產品屬性（例如QTPP和CQA）；（2）通過工藝設計來實現這些屬性；（3）通過穩(wěn)健的控制策略來保證工藝性能的穩(wěn)定；（4）對工藝進行驗證和文件化來證明控制策略的有效性；（5）繼續(xù)在產品的生命周期內進行監(jiān)測，來保證穩(wěn)健的工藝性能。此外，通過知識管理、風險評估和管理、原料管理、統(tǒng)計學方法以及過程分析技術來為QbD的實施提供基礎。

　　QbD應用于工藝開發(fā)

　　i. 確認CQA

　　將CQA定義為“物理、化學、生物或微生物學屬性，或是對特征進行適當的限定、范圍或分布進行描述來保證目標產品質量”。由于工藝開發(fā)應當關注于實現目標產品CQA定義的質量達到想要的一致性，因此在工藝開發(fā)前就需要確認產品的CQA。在產品開發(fā)的所有關鍵階段都需要對CQA名單進行回顧，以便保證非臨床、穩(wěn)定性和臨床研究的數據更加可靠。當這些發(fā)生時，需要進行工藝能力評估。

　　ii. 定義產品設計空間

　　“設計空間”這個概念作為一個工具已經普遍的應用于生物藥QbD的實施。ICH Q8將其定義為：輸入變量（比如物料屬性）的多維組合和交互作用以及已被證明的能夠為產品質量提供保證的工藝參數。只要是在設計空間內進行的操作，不認為是變更。而在設計空間外的操作才被認為是變更，并且一般情況下要通過監(jiān)管機構批準工藝變更后才能使用。設計空間是由申請人提議的，并且要受監(jiān)管的評估與批準。

　　一旦確認CQA，下一步就要定義CQA變量的可接受水平。設計空間窗口的大小直接影響工藝開發(fā)，如果產品設計空間較?。藴室蟊容^嚴），那么工藝參數同樣要控制在較小的操作范圍內來保證產品能夠達到標準。相反，如果產品設計空間較大（標準要求寬松），那么工藝就相對靈活一些。

　　iii. 定義工藝設計空間

　　在定義CQA和可接受的變量范圍后，應進行工藝特征研究將CQA和工藝每一步的工藝變量、原料屬性和進料屬性相聯(lián)系。在QbD范例中通過DoE方法來進行研究的，這樣不僅可以明白變量的主要影響，而且也可以弄明白它們間的交互作用。研究結果在復合、多維和經驗的模型形式中是比較典型的，而該模型能夠將不同的CQA和多種因子相聯(lián)系。

　　iv. 定義控制策略

　　控制策略定義為：源于對現行產品和工藝的理解，能夠保證工藝性能和產品質量的有計劃的一些列控制活動。在QbD中，控制策略要圍繞著規(guī)定工藝能力和產品CQA。上述的經驗模型能典型的用于定義有效的工藝參數的可接受范圍。然后通過控制策略來保證工藝能夠按既定軌道進行，并且產品的質量能夠始終如一的滿足預定義的質量要求。

　　v. 描述產品特征

　　一旦定義并實施了控制策略，就要進行適當的產品質量監(jiān)控來證明設計的工藝具有穩(wěn)定的生產出能達標產品的能力。這一活動也是對QbD能用于工藝開發(fā)的驗證。

　　實施QbD的動力

　　實施QbD具有如下幾個動力：

　　（1）QbD中的操作范圍是比較寬泛的，這來源于經確認的影響CQA的關鍵工藝參數的鑒別。這與傳統(tǒng)的制造業(yè)形成鮮明對比，由于工藝開發(fā)者并不知道哪個工藝參數是關鍵的，傳統(tǒng)制造業(yè)的所有工序的操作范圍是比較窄的。（2）在QbD中產品質量參數范圍是比較寬泛的，這是因為產品的質量是基于對工藝和產品的理解而制定的。這促使我們的操作具有一定的靈活性，特別是對非CQA而言，而這種靈活性主要體現在比較寬的操作范圍。

　?。?）更穩(wěn)健的工藝。以動態(tài)控制策略為基礎的過程分析技術能開發(fā)出更穩(wěn)健的工藝，該工藝能夠實現目標產品的質量是始終如一的。

　?。?）顯著降低失敗風險，因為在QbD中我們是按照PAT范例進行實時或接近實時的產品質量測試的。

　　（5）工藝變更負擔小。QbD的監(jiān)管機構備案文件是知識的基礎，它關注于闡述工藝和CQA以及CQA和產品的安全性和有效性的關系。而傳統(tǒng)的備案文件要羅列出所有參數和屬性，包括CPP和非CPP，CQA和非CQA。因此，當需要做工藝變更時，我們的備案文件也需要做變更。這給生物技術企業(yè)帶來巨大的負擔，這也是為什么企業(yè)都傾向于保守并且拒絕接受新的技術和實踐。

　?。?）更少的生產偏差。有效的生產能將QbD貫穿于產品的整個生命周期中，這使得操作范圍和質量參數比較寬泛，從而減少生產偏差。由于生產商已經有數據對偏差對產品質量的影響進行了闡述，因此當出現任何與前面所描述的數據不一致時我們可以相對迅速的將其解決。

　?。?）得到更理想的工藝。在試驗過程中廣泛的使用DoE進行優(yōu)化，并考慮生產力和經濟學，這能夠開發(fā)出比較理想的工藝。通過DoE選擇的條件是全局最優(yōu)條件，而不僅僅是局部的最優(yōu)條件。因此工藝是比較穩(wěn)健的，并且可以避免不必要的昂貴的返工。

　　下面本文將結合下面給出的案例淺談一下怎樣才能實現以上描述的益處。

　　通過QbD進行一個仿制藥產品的下游工藝開發(fā)的案例研究

　　在本章節(jié)中將會提供一個案例來說明QbD是如何在生物仿制藥（GCSF）下游工藝開發(fā)中實施的。本章節(jié)的案例來自于對先前已經發(fā)表過的研究的總結。

　　i. 確認CQA

　　為了確定GCSF的CQA，我們進行了全面的文獻檢索、GCSF商業(yè)生產商的調查以及現存的GCSF的相關著作，結果如表1。表1中，CQA能夠分為幾類：產品相關變體雜質、宿主細胞雜質、設施相關屬性和與生物治療藥建立同一性和效力相關的東西。

　　產品相關的變體和雜質是一類重要的值得進一步討論的分類，對于GCSF而言需要進一步考慮的關鍵屬性包括產品的氧化、還原、聚體和fMet的形式。有人認為蛋氨酸的氧化能導致蛋白的物化性質改變，從而使蛋白失去生物活性。同樣的，GCSF的還原形式同樣被認為是對其生物活性有影響的。此外異源蛋白的高水平表達已經被證明了其能夠導致GCSF N甲酰蛋氨酸變體形式的甲?；鶊F部分保留。但是與天然GCSF蛋白相比，我們認為變體是有相同的生物活性的。它的存在可能會引起病人的免疫原性反應，因此需要監(jiān)測和控制其含量。最后，聚體被普遍的認為能夠引起病人的免疫原性反應，因此將其作為生物治療藥的CQA考量。正如表1描述的那樣，首先應該關注的是能夠被下游工藝影響的CQA。

　　本案例中關注的是生物仿制藥產品的下游工藝開發(fā)，首先通過文獻檢索來建立CQA。如果是進行開發(fā)創(chuàng)新要的話，過程將會有所不同。在本案例的基礎上，應當通過其它方法進行重要的補充。經常的，該策略應當涉及以下幾方面的風險評估：分子（熱點和分子工程）設計；產品和其它平臺產品通過體內和體外實驗進行非臨床研究；產品和其它平臺產品的臨床研究；發(fā)表的文獻。風險評估的結果應該是危急程度的連續(xù)統(tǒng)一體，產品質量屬性應該羅列其中。對安全性和有效性有影響的（比如聚體種類）應當排在高危急程度位置，對安全性和有效性沒有影響的（例如C末端賴氨酸雜質）排在低危急程度位置。

　　ii. 定義產品設計空間

　　表1羅列了本案例選擇的產品質量參數，這主要是基于GCSF專著提供的相關信息。這些數據將會進一步用于下游工藝的設計。

　　iii. 定義工藝設計空間

　　本步驟是本案例中關注的重點，涉及了多個步驟方法的應用，包括：復性工藝的優(yōu)化；建立高通量工藝開發(fā)平臺應用于層析工藝開發(fā)；多種層析模式的評估；工藝整合。本步驟的關鍵點是為每個工序建立一個合適的縮小的規(guī)模，該規(guī)模在使用前必須保證是有效的，以便保證在研究過程中產生的數據能適用于商業(yè)化規(guī)模生產。

　　我們將使用基于QbD的DoE方法進行復性工藝優(yōu)化。首先我們通過風險分析來確定需要進行試驗考察的工藝參數（圖2A）。接下來，我們通過部分因子初篩試驗設計（圖2B）來考量溫度；復性pH；包涵體、尿素、半胱氨酸以及DTT的濃度。基于以上研究結果，我們將使用全因子DoE試驗對pH、尿素濃度以及DTT濃度做進一步考量，來闡述其對每一步得率和產品質量的影響，以及他們之間的交互作用（圖2C）。結果本工藝的復性率能達到77 %，這遠高于商業(yè)化的GCSF的復性率（40-60 %）。最終將產品的設計空間設定為可接受的范圍：得率大于70 %；蛋白濃度大于0.18 mg/ml；氧化的雜質小于15 %；尿素濃度6-6.6 M；pH 9.5-10.2；DTT 0.92-1.8 mM。設計空間的說明見圖2D。高回收率和CPP寬泛的設計空間能夠體現遵循QbD的方法進行工藝開發(fā)的價值。

　　接下來的工作是建立復性后的純化工藝。通過商業(yè)調查我們發(fā)現，目前應用于商業(yè)化生產GCSF的工藝模式主要是：陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水復合模式層析（按受歡迎程度下降的順序）。每個層析步驟能夠使用結合-洗脫模式或流穿模式?；谥暗闹R和商業(yè)調查，我們決定關注用于GCSF純化的陽離子交換層析、陰離子交換層析以及復合模式層析進行評估，結果見圖3。

　　考慮到需要做大量的層析試驗，我們開發(fā)了高通量工藝開發(fā)平臺。為了達到這個目的，我們選擇了GE醫(yī)療的Predictor PlateTM進行試驗。我們發(fā)現手動操作2-6 μl規(guī)模存在一定的挑戰(zhàn)，因此我們需要開發(fā)一個能夠有效降低這種挑戰(zhàn)的方案，最終我們將HTPD平臺和傳統(tǒng)的實驗室0.5 ml規(guī)模的結果進行對比，結果表明HTPD平臺能夠成功的用于工藝開發(fā)。雖然HTPD平臺中每一步的收率的絕對值較低，但是其趨勢是正確的。因此該平臺能夠應用于半定量評估多種輸入參數的影響（圖3A）。在實際應用之前我們認為該模型是具有統(tǒng)計學意義的。但通過進一步調查研究發(fā)現，造成每一步收率低的原因是HTPD膜板對GCSF有非特異性吸附。而且其它一些疏水作用不強（比如單克隆抗體）的蛋白的非特異性吸附作用是可以忽略的。

　　一旦HTPD平臺開發(fā)成功，我們能將其用于多種層析填料和不同模式下的操作條件進行快速篩選。首先，我們通過HTPD平臺對5家主要供應商的9種不同的陽離子交換層析填料進行篩選。通過DoE的方法對每種填料的最優(yōu)條件進行優(yōu)化，包括pH和緩沖液摩爾濃度。之后要在傳統(tǒng)實驗室規(guī)模進行洗脫策略的優(yōu)化。結合-洗脫模式的陽離子交換層析GCSF純化的最優(yōu)結果表明，其最高回收率能達到80 %。相似的，我們通過HTPD平臺對4家主要供應商的8種不同的陰離子交換層析填料進行結合-洗脫和穿透模式篩選。結果表明，在結合-洗脫模式時，陰離子層析的收率小于30 %。這主要是因為在低pH（譯者認為應該是高pH，結合是在高pH，穿透模式是低pH）下GCSF非常不穩(wěn)定。而在穿透模式下，產品收率幾乎達到100 %，并且宿主細胞雜質顯著降低（DNA約0.5個log降，HCP 大于1個log降）。最后，通過HTPD平臺對復合模式層析填料進行評估。HTPD平臺結合傳統(tǒng)實驗室步驟對每種填料進行優(yōu)化，最終僅使用復合形式填料就能使收率達到90.0 %，同時純度大于99.0 %（圖3B）。這很可能是因為通過pH和鹽濃度進行梯度洗脫的疏水離子復合層析對相關產品的變體的分離有特異選擇性。

　　因此，最終優(yōu)化后的工藝為：通過pH調節(jié)進行復性——一步疏水離子復合層析。

　　iv. 定義控制策略

　　控制策略是QbD的關鍵組成部分，同時也是過程分析技術的基礎。在本案例中，控制策略涉及受下游純化工藝影響的產品相關的CQA，即氧化、還原和聚體種類。在復性和純化工序中，通過監(jiān)測產品質量來評估分析工具的實用性。包括：RP-HPLC、傅里葉變換紅外光譜、紫外圓二色譜、SEC-HPLC、熒光?？紤]到靈敏度、精度、分析時間和可操作性，我們決定將RP-HPLC和SEC-HPLC用于監(jiān)測GCSF復性工序，將RP-HPLC用于在線監(jiān)測復合模式純化工序的洗脫液（在線分析技術）。不同文獻資料表明，產品目標CQA的一致性的顯著提高是我們在實施PAT策略時所愿看到的。

　　v. 描述產品特征

　　QbD范例中生物藥工藝開發(fā)是建立在產品質量始終如一的基礎上的。產品質量是主要的優(yōu)化目標，比如：工藝的收率、生產力和生產周期。在本仿制藥的案例中，產品質量的評估要與原研藥進行可比性研究。在這個過程中，我們需要進行大量的可比性研究分析，將我們的GCSF與原研藥和上市的GCSF仿制藥進行對比。一些關鍵的結果見圖4。

　　該過程的第一步是確認產品的身份，可通過質譜進行確認。圖4Ai是通過復合模型柱純化的GCSF的質譜圖，圖4Aii是質譜圖的去卷積質譜圖。結果表明，GCSF仿制藥中的主要成分是GCSF蛋白，該蛋白序列中N末端帶有蛋氨酸殘基，但沒有發(fā)生糖基化。還原和非還原消化LC/MSE肽圖確定了含有N末端蛋氨酸GCSF的氨基酸序列和二硫鍵。這些結果表明我們的產品是GCSF，并且在整個工藝中沒有發(fā)現結構變體。

　　下一步就是鑒定HCP（圖4B），因此我們選擇了二維交聯(lián)凝膠電泳和UPLC-MS。我們在復性工藝產物中發(fā)現了多種HCP，我們將通過二維凝膠電泳做進一步描述。其中一些HCP能夠被確定為典型的大腸桿菌表達蛋白。

　　最后，通過宿主分析工具進行分析可比性評估。圖4Ci的SEC-HPLC表明GCSF產品和原研藥產品中幾乎不含有聚體（0.2 %和0.15 %）。同樣的，RP-HPLC分析結果表明通過QbD方法生產的GCSF蛋白的質量與上市的原研藥或其它仿制藥相比不僅相似，而且要更好（圖4Cii）。鑒于GCSF含有α螺旋結構，因此首要考慮的比較性質就包括在圓二色譜中208 nm和220 nm處有下降。圖4Ciii可以看出兩個蛋白的圖譜匹配較好，這表明GCSF和市售藥都含有α螺旋結構，而且沒有其它結構變體。通過SDS-PAGE非還原電泳進行高、低分子量水平的相似性比較，結果與SEC-HPLC的結果相一致，仿制藥和市售藥的質量一致，并且?guī)缀鯖]有高分子量蛋白。最后，通過體外生物檢測法來確定GCSF的生物活性。我們的GCSF的生物效價是市售GCSF的89.3 %，在產品規(guī)格范圍之內（80-120 %）。這表明了我們的GCSF保持了結構完整性和功能完整性。

　　實施QbD的益處

　　表1中的數據是通過QbD方法生產的GCSF蛋白的分析數據，表明其質量達到了市售產品的質量標準。此外通過圖4可以看出生產的GCSF要優(yōu)于市售產品。另外，表2比較了通過QbD方法生產的GCSF和市售GCSF的純化工藝。通過QbD方法生產的GCSF的工藝包括：通過pH調節(jié)進行復性——過濾——復合模式層析純化。市售蛋白工藝包括：通過換液方式（超濾/透析或凝膠過濾方式）進行復性——3到4步色譜純化（中間還要通過超濾/透析或凝膠法換液）。QbD方法得到的蛋白純化工藝不僅工藝收率提高3倍，而且工藝時間縮短3倍，因此生產工藝的生產力提高了近10倍。鑒于目前成本壓力以及生物技術行業(yè)都在關注降低生物藥生產成本，這是非常有意義的。

　　通過執(zhí)行上述提議的工藝將會實現多個主要益處，其中一些已經在本案例中體現了。由于我們的試驗數據是通過DoE試驗（圖2D和3B）得到的，我們能夠定義更寬泛的合適的可接受范圍和操作空間。雖然寬泛的產品質量規(guī)格不在本文范圍之內，但是我們還是努力關注產品開發(fā)能夠達到其質量規(guī)格。如上所述，我們提議了基于控制策略的動態(tài)PAT技術（通過RP-HPLC和SEC-HPLC監(jiān)測GCSF的復性工序和RP-HPLC監(jiān)測其復合模式純化色譜工序），這已經展現了其顯著改善產品一致性的能力，這能增加工藝的穩(wěn)健性。作為上述控制策略益處的一個補充：在生產過程中產品質量就被檢測了，并且最終制劑的檢測項也會顯著降低。原液和制劑的哪些屬性需要檢測最終還是要生產商去決定。如圖2和圖3所示，監(jiān)管備案文件應包括工藝和產品之間的聯(lián)系。這樣監(jiān)管機構就能知道哪些參數的重要的，哪些是可接受的范圍。例如：蛋白復性案例中，pH、尿素和DTT濃度是關鍵工藝參數，基于對它們的控制能力我們規(guī)定了三個參數的合適的設計空間（圖2D）。并且我們可以給非關鍵參數規(guī)定更寬的設計空間（比如包涵體濃度），這樣我們的生產就會更靈活，并且監(jiān)管的壓力更小。我們希望高效的生產能貫穿于整個產品的生命周期，因為本案例中的數據明確的規(guī)定了設計空間，并且能夠快速的解決生產過程中的任何不合格問題。最后，關于最優(yōu)工藝的生產力和生產經濟性在上文中已經進行了詳細的說明，包括：生產工藝時間算短3倍；生產力提高了10倍。

　　總之，我希望上面的討論能夠說明通過QbD的實施是能得到很大益處的。

　　結束語

　　QbD是在2004年通過PAT指南發(fā)布時引入到生物技術行業(yè)的。在過去的十年里，在生物技術企業(yè)和其監(jiān)管機構的共同努力下，對QbD實施的路線圖進行了說明。當大家普遍的接受了這個概念，并且多數大的生產企業(yè)已經處在將QbD整合到各種工作中的高級階段時，中小生產企業(yè)還在為QbD的成功實施進行不懈努力。對本案例的分析主要是為了通過展示QbD方法的益處來推廣QbD。QbD的實施通常是資源集中的。本研究是兩個全職等效資源的成果，這比生物技術企業(yè)在相似的工藝開發(fā)中所花費的資源要小的多。

　　我希望有更多的這樣的研究能夠分享到公共領域，因為這不僅能回答實施QbD所面臨的各種問題，而且為實施QbD闡明了必要的商業(yè)驅動。